Inmunodetección con nanopeptámeros construídos con subunidades de proteínas oligoméricas

El ensayo PHAIA (phage anti-immunocomplex assay) consiste en la inmunodetección “sándwich” de moléculas pequeñas (haptenos) y ha sido descrito inicialmente en nuestro laboratorio como una alternativa a los inmunoensayos de competición clásicos para la detección de haptenos. En estos inmunoensayos se utilizan péptidos que reconocen de forma específica inmunocomplejos formados por un analito problema y su anticuerpo específico. Dichos péptidos son expresados en la superficie de fagos y la señal del inmunoensayo es generada mediante el uso de anticuerpos anti-fagos conjugados a peroxidasa. Pese a la alta sensibilidad obtenida por los ensayos PHAIA, es de gran interés generar reactivos del inmunoensayo en los que el péptido anti-inmunocomplejo no esté expresado en partículas virales, y que a su vez esté asociado a una actividad enzimática que genere la señal del ensayo (con el objetivo de desarrollar un reactivo de uso comercial). Con este fin, se ha comenzado con desarrollos alternativos que permiten la producción de péptidos libres de fagos pero fusionados a proteínas multiméricas de modo de alcanzar multivalencias que eran inherentes en los fagos. Este complejo péptido-proteína multimérica, al cual denominamos “nanopeptámeros”, se construye y se expresa de forma recombinante a partir de sistemas de expresión en bacterias E. coli. Entre las proteínas multiméricas que usamos en estas construcciones, en este trabajo presentamos la subunidad B de la toxina Verotoxina, una proteína homopentamérica, de pequeño tamaño y con una demostrada ductilidad a la hora de su producción recombinante en células de E. coli. En este marco, se plantea la construcción de estos nanopeptámeros de forma de aplicarlos como reactivos en los inmunoensayos de detección de haptenos, más precisamente se trabajará con el modelo para detección del herbicida Clomazone. Entre los nanopeptámeros aplicados en el trabajo, se probarán alternativas tanto en la secuencias de péptidos como en la estructura pentamérica de la Verotoxina. Específicamente, se trabajará con nuevas generaciones de péptidos que reconozcan el complejo clomazone-AcMo con mayor afinidad que los péptidos ya disponibles, así como también se explorarán aspectos estructurales de la verotoxina al ensamblar la subunidad B pentamérica con la correspondiente subunidad A teniendo en cuenta que el ensamblaje podría influenciar en la estabilidad y en la correcta formación pentamérica de la misma. Con estas nuevas variables apuntamos a la obtención de un nuevo reactivo, que debido a su multivalencia alcanzada y a la obtención de péptidos más afines, nos permita obtener inmunoensayos de alta sensibilidad para el monitoreo de analitos. Particularmente, el énfasis que le damos a esto último recae en nuestro enorme interés en traspasar este tipo de formato a los formatos de flujo lateral en tiras de diagnostico, con lo que resulta imprescindible obtener desde un principio (ya en el formato en placa de ELISA) ensayos sumamente sensibles y robustos debido a la complejidad y dificultades técnicas que acarrean el desarrollo de cualquier método de inspección visual.