Desarrollo de un Sistema de biotinilación in vivo para el screening y caracterización en gran escala de anticuerpos de monodominio específicos para receptores de células dendríticas.

Además de los anticuerpos convencionales, los camélidos también generan una familia de anticuerpos muy particular, denominada anticuerpos de cadena pesada, que carecen de cadena liviana. La ausencia de esta cadena no imposibilita que sean capaces de reconocer los antígenos para los cuales son específicos con alta afinidad, sino que se adaptaron evolutivamente para lograrlo y además eso le confiere nuevas propiedades fisicoquímicas, como mayor solubilidad cuando se los expresa en sistemas procariotas y alta estabilidad a condiciones extremas de pH y/o temperatura. Dada la simplicidad en el mecanismo de reconocimiento de antígenos el dominio variable de estos anticuerpos puede ser manipulado mediante biología molecular para generar “Nanobodies o VHHs”, proteínas que representan el menor fragmento funcional de los anticuerpos. Su pequeño tamaño, estabilidad, solubilidad y altos rendimientos de expresión en sistemas procariotas los hace muy atractivos para la preparación de antígenos quiméricos inmunomoduladores. En ese caso el antígeno de interés es fusionado a un VHH específico para un receptor particular de células dendríticas (DCs), confiriéndole propiedades (1) endocíticas, induciendo la endocitosis mediada por receptor (targeting de antígenos) o, (2) inmunoestimuladoras, en el caso de interaccionar con receptores de reconocimiento de patrones (PRR). En cualquiera de las dos situaciones se lograría potenciar la respuesta inmune para el antígeno al cual se encuentra fusionado el nanobody, el cual, de forma intrínseca no tiene dichas propiedades. Para proceder con la selección de esta clase de anticuerpos construimos una biblioteca de Nanobodies expresados sobre la superficie del fago M13, generada a partir de la inmunización de llamas con DCs murinas. La biblioteca, de un tamaño de 109 transformantes, fue sometida a un proceso de selección utilizando DC murinas enteras y el éxito de la selección fue evaluado mediante citometría de flujo utilizando los anticuerpos expresados en las partícula virales. Mediante esta metodología hemos seleccionado varios anticuerpos que interaccionan con las DCs pero pretendemos desarrollar una estrategia general de selección y caracterización de antígenos “en masa” aprovechando las ventajas de la interacción biotina/streptavidina y la amplia disponibilidad de reactivos para este sistema. En base a estos antecedentes proponemos generar las herramientas y condiciones para expresar los Nanobodies biotinilados in vivo dentro de la bacteria de forma dirigida, algo que no es posible si se pretende hacerlo de forma artificial con el reactivo NHS-biotina que biotinila en todas las lisinas de la secuencia proteica, interfiriendo muchas veces en la interacción antígeno anticuerpo. El desarrollo de un sistema de biotinilación in vivo va a permitir obtener un método muy versátil, rápido y genérico de selección y caracterización de anticuerpos que, a partir de un pequeño cultivo bacteriano, va a permitir la identificación de los VHHs mediante citometría de flujo y la caracterización del antígeno para el cual es especifico mediante ensayos de inmunoprecipitación con resina de estreptavidina conjugada a sefarosa y análisis de espectrometría de masa.