Investigación y desarrollo de un inmunosensor para el aislamiento y cuantificación de exosomas en sobrenadante de cultivos celulares.

Los exosomas son vesículas extracelulares menores a 100nm secretados por la mayoría de las células, pero muy especialmente por las células tumorales. Si bien, considerados anteriormente como medios de excreción de desechos celulares, cada vez existe más evidencia sobre el rol de estas vesículas en la comunicación célula-célula a distancia, y en particular, en la biología del cáncer. En 2007 se describió que los ARNs mensajeros y los micro-ARNs exosomales mantenían su capacidad de ser traducidos y de silenciar genes (respectivamente) al ser internalizados por las células receptoras. Como las células tumorales presentan un perfil de micro-ARNs característico, los exosomas han cobrado interés por su capacidad de contener biomarcadores tumorales circulantes, detectables en sangre, saliva y orina. A pesar de su enorme potencial diagnóstico, las tecnologías actuales para la purificación y análisis de exosomas son laboriosas y/o costosas, por lo tanto proponemos el desarrollo de un inmunosensor de base electroquímica para el aislamiento y cuantificación de exosomas a partir de sobrenadante de cultivos celulares. Un biosensor electroquímico es un dispositivo que permite la detección y cuantificación de sustancias o entidades específicas (analitos) mediante el monitoreo de señales eléctricas. Dichas señales eléctricas se originan o se modifican a partir de la unión del analito sobre la superficie del biosensor. A gran escala, nuestra aproximación experimental consiste en inmovilizar anticuerpos contra proteínas de superficie exosomales (CD63, CD9, CD81, etc.) sobre electrodos serigrafiados de oro y carbono. Los electrodos serigrafiados de oro se modificaran mediante una matriz autoensamblada -SAM-. Se utilizaran exosomas y ectosomas (éstos últimos son el control de uniones inespecíficas, pues los ectosomas constituyen el interferente más probable en una muestras biológicas reales) obtenidos a partir de medios de cultivos de las líneas celulares MCF-7 y MCF-10. Los exosomas purificados se introducirán en los electrodos, quedando los mismos retenidos en la superficie (interacción específica anticuerpo antiproteína de superfice exosomal-proteína de superficie exosomal). Los electrodos incubados con exosomas, ectosomas, o con una mezcla de ambos además del monitoreo electroquímico (voltametría cíclica y espectroscopía de impedancia) se analizarán por microscopía electrónica de barrido (SEM), ya que los exosomas pueden distinguirse fácilmente por su menor tamaño. La combinación del monitoreo electroquímico y el posterior análisis microscópico permitirá verificar y corroborar el aislamiento del mayor número posible de exosomas.