Poli-ADP-ribosilación y respuesta al daño genético inducido en células VERO.

El ADN puede ser dañado a causa de agentes endógenos (por ejemplo, radicales libres) o exógenos (radiaciones ionizantes, agentes radiomiméticos como la bleomicina o BLM). Las roturas de cadena doble son lesiones severas, ya que si no son bien reparadas, la célula puede sufrir apoptosis o coexistir con los daños, originando inestabilidad genómica e incluso pudiendo favorecer el cáncer. Existen distintos mecanismos de reparación del ADN según el tipo de daño. Las roturas de doble cadena (RCD) se reparan mediante recombinación homóloga (HR) y recombinación no homóloga (NHEJ) canónica (C-NHEJ) o alternativa (A-NHEJ). La poli-ADP-ribosilación (PARilación) es una modificación postraduccional de proteínas que consiste en el agregado de poli-ADP-ribosa (PAR) catalizado por poli-ADP-ribosil polimerasas (PARPs). PAR puede ser degradado principalmente por la poli-ADP-ribosil-glicohidrolasa (PARG). De la familia de las PARPs, PARP-1, PARP-2 y PARP-3 (ésta última con actividad mono-ADP-ribosilante) han sido involucradas en vías de reparación del ADN y de RCD en particular. En células VERO, una dosis de BLM de 50 ug/mL indujo la fosforilación de la histona H2AX en Ser 139, originando señales detectables por inmunocitofluorescencia denominadas foci H2AX, así como H2AX pan-nuclear, pero no se observó un aumento de PAR 1 h post-tratamiento. Estudiando la viabilidad celular, se observó que no hubo potenciación en el efecto de la BLM al aplicar los inhibidores de PARPs denominados 3-AB y EB. El objetivo del presente proyecto es establecer los motivos por los cuales no se evidenció PARilación en respuesta al daño producido por BLM en células VERO en las condiciones estudiadas. A modo de hipótesis planteamos que las células VERO optan por reparar las RDC producidas por BLM mediante C-NHEJ o A-NHEJ dependiendo de la dosis. Además postulamos que al bloquear la vía C-NHEJ, se conduce a las células a optar por la vía A-NHEJ, la cual es PARP dependiente. Se realizarán ensayos de inmunocitofluorescencia para evaluar la relación dosis-respuesta a BLM, y para establecer la cinética de formación de foci H2AX y de PARilación durante dicho proceso. Luego se realizará un estudio de viabilidad de las células frente a la BLM, utilizando la técnica de MTT. Se estudiará si existe potenciación del efecto de BLM a diferentes dosis con el inhibidor de PARPs Olaparib (más potente y específico que los utilizados anteriormente), pre-, durante y post- tratamiento. Cada uno de estos estudios se realizará con dosis baja y alta de BLM. Si no se logra evidenciar PARilación, se estudiará si hay potenciación del efecto de BLM al bloquear la vía C-NHEJ mediante un inhibidor de DNA-PK o de Ligasa IV. Al culminar este proyecto se espera verificar si realmente existe inducción de PARilación en respuesta al daño genotóxico en respuesta a BLM en células VERO y revelar la cinética de este proceso. Además se intentará determinar si estas células efectivamente utilizan en algunas condiciones C-NHEJ, que es independiente de PARP-1 y PARP-2. La importancia de investigar más a fondo la acción de los inhibidores de PARP y su efecto sobre las vías de reparación radica en las posibles aplicaciones en al área de la salud, más específicamente en los tratamientos contra el cáncer. Actualmente, se están realizando pruebas en el ámbito clínico con los distintos inhibidores de PARPs con el fin de obtener una nueva terapia para ésta enfermedad.