Inactivación oxidativa de la glutamina sintetasa humana

La glutamina sintetasa (GS) es una enzima clave en el metabolismo de mamíferos que cataliza la síntesis ATP-dependiente de glutamina a partir de glutamato y amonio. A nivel del sistema nervioso central, se localiza principalmente en el citosol de astrocitos, donde, además de detoxificar amonio, juega un rol principal en el mantenimiento del ciclo glutamato-glutamina, removiendo el exceso de neurotransmisor glutamato y previniendo así los eventos de excitotoxicidad. Debido a este rol clave en el mantenimiento de la homeostasis cerebral, cambios en los niveles o actividad de la GS pueden resultar en disfunción de la astroglía, afectando así severamente la supervivencia neuronal. De hecho, tanto en modelos animales como en pacientes humanos, se ha relacionado la pérdida de actividad GS con desórdenes neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer. En varios de estos casos se observó también un incremento en el grado de oxidación de la GS, sugiriéndose una correlación entre ambos fenómenos. Diversos estudios in vitro han evidenciado la inactivación de la GS luego de su exposición a oxidantes de relevancia biológica como el peroxinitrito (ONOO-), sugiriéndose que la inactivación ocurría por la nitración de residuos de tirosina de la GS a 3-nitrotirosina (NO2Tyr). Además, la nitración e inactivación de la GS fue observada en sistemas celulares y modelos animales, reafirmando la posibilidad de que el daño nitro-oxidativo esté mediando la pérdida de actividad GS en procesos patológicos. En ese contexto, nuestro grupo de investigación comenzó en 2014 a estudiar la inactivación de la GS humana recombinante por ONOO-, a efectos de comprender los mecanismos moleculares implicados en la pérdida de actividad de la GS por modificaciones nitro-oxidativas. Si bien encontramos que la GS humana resulta nitrada e inactivada por ONOO-, observamos que el tratamiento con ONOO- induce otros fenómenos oxidativos en la proteína, que podrían también estar implicados en la inactivación de la enzima. En particular, la formación de entrecruzamientos covalentes (no reducibles) de subunidades de GS luego de su exposición a ONOO- se presentó como una modificación con una importante correlación con el proceso de inactivación de la enzima. También, se observó que luego del tratamiento con ONOO- se forman especies agregadas de alto peso molecular de la GS humana, que incluso llegan a formar agregados insolubles que precipitan. Por lo tanto, elucidar el proceso de inactivación nitro-oxidativo de la GS humana implica considerar estos fenómenos en conjunto con la formación de NO2Tyr. En el presente proyecto se plantea continuar los estudios sobre la inactivación oxidativa de la GS humana, para comprender los mecanismos moleculares mediante los cuales las modificaciones nitro-oxidativas de la GS causan su inactivación. En particular, se buscará identificar los principales residuos modificados, especialmente tirosinas nitradas y entrecruzadas (formando 3,3’-ditirosina) y su impacto en la actividad enzimática. De igual modo, se caracterizará el proceso de agregación de la GS humana luego de su exposición a oxidantes, qué tipo de modificaciones nitro-oxidativas la inducen y que rol juega en la pérdida de actividad GS en condiciones de estrés nitro-oxidativo.